Desarrollo y validación de un 21 - Grupo Co., Ltd de Kunming PCBA

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12526 (2023) Citar este artículo

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Los resultados de supervivencia de los pacientes con neuroblastoma varían notablemente y faltan marcadores de pronóstico confiables y herramientas de estratificación del riesgo. Buscamos identificar y validar una firma transcriptómica capaz de predecir el riesgo de mortalidad en pacientes con neuroblastoma. Se utilizó el conjunto de datos TARGET NBL (n = 243) para desarrollar el modelo y dos cohortes independientes, E-MTAB-179 (n = 478) y GSE85047 (n = 240) se utilizaron como conjuntos de validación. La SSC fue el resultado primario y la SG fue el resultado secundario de interés para todos los análisis. Identificamos una firma de 21 genes capaz de estratificar a los pacientes con neuroblastoma en grupos de alto y bajo riesgo en E-MTAB-179 (HR 5,87 [3,83–9,01], p <0,0001, AUC a 5 años 0,827) y GSE85047 (HR 3,74 [2,36 –5,92], p < 0,0001, AUC a 5 años 0,815) cohortes de validación. Además, la firma permaneció independiente de las variables clínico-patológicas conocidas y siguió siendo pronóstica dentro de subgrupos clínicamente importantes. Además, la firma se incorporó eficazmente en un modelo de riesgo con variables clínico-patológicas para mejorar el rendimiento del pronóstico en todas las cohortes de validación (Validación agrupada HR 6,93 [4,89–9,83], p <0,0001, AUC a 5 años 0,839). También se demostró una utilidad pronóstica similar con la OS. La firma identificada es un predictor independiente sólido de los resultados de SSC y SG en pacientes con neuroblastoma y se puede combinar con variables clínico-patológicas utilizadas clínicamente para mejorar el rendimiento del pronóstico.

El neuroblastoma es el tumor sólido extracraneal más común en niños y representa aproximadamente del 7 al 10 % de todos los cánceres infantiles1,2,3. El neuroblastoma se caracteriza por una heterogeneidad sustancial en las características del tumor4,5,6 y los resultados de los pacientes, que van desde la regresión espontánea en algunos pacientes7 hasta la enfermedad metastásica resistente al tratamiento en otros8. Dada esta heterogeneidad, se han desarrollado múltiples sistemas de estadificación para estratificar el riesgo de los pacientes diagnosticados con neuroblastoma. El Sistema Internacional de Estadificación del Neuroblastoma (INSS) es un sistema de estadificación posquirúrgico, desarrollado en 1986, que utiliza la ubicación de la enfermedad, el estado de los ganglios linfáticos y la extensión de la resección quirúrgica para la clasificación de los pacientes9,10. El INSS ha sido reemplazado en gran medida por el Sistema Internacional de Estadificación del Grupo de Riesgo de Neuroblastoma (INRGSS), que se formó en 2005 para crear una clasificación de estadificación independiente de los hallazgos de la resección quirúrgica. Esta herramienta utiliza la presencia de factores de riesgo definidos por imágenes (IDRF) para categorizar los tumores locorregionales como L1 (IDRF ausente) o L2 (IDRF presente)11,12. Ambas herramientas han demostrado consistentemente una fuerte asociación con los resultados de supervivencia11,12,13.

Además de estos sistemas de estadificación bien establecidos, numerosos estudios han identificado otras características clínicas, patológicas y genómicas asociadas con la supervivencia en el neuroblastoma. Por ejemplo, la edad del paciente en el momento del diagnóstico representa una variable pronóstica importante, y se ha demostrado sistemáticamente que los pacientes de mayor edad (a menudo definidos como aquellos mayores de 18 meses de edad) experimentan peores resultados8,14. Se ha demostrado que la amplificación del número de copias de MYCN se asocia de forma independiente con malos resultados clínicos y se encuentra en aproximadamente el 25% de los casos de neuroblastoma y el 40% de los casos de alto riesgo15. Otras aberraciones cromosómicas segmentarias, como la deleción del cromosoma 1p, la deleción 11q o la ganancia de 17q, también se han asociado con malos resultados de supervivencia en el neuroblastoma16,17. Además, se han identificado características moleculares y patológicas como la categoría histológica18, la ploidía del ADN19 y el grado de diferenciación tumoral como marcadores pronósticos en el neuroblastoma.

Por lo tanto, los enfoques de tratamiento actuales se basan en gran medida en puntuaciones de clasificación de riesgo que incorporan el sistema de estadificación INRGSS junto con una combinación de características clínicas, patológicas y genómicas que han mostrado una asociación con la supervivencia en el neuroblastoma. Entre los puntajes más reconocidos se encuentra el criterio de clasificación de riesgos del Children's Oncology Group (COG) revisado en 20218. Este sistema de puntuación utiliza el estadio INRGSS, así como la edad en el momento del diagnóstico, la clasificación histológica y la presencia de biomarcadores moleculares y patológicos como el estado de amplificaciones de MYCN, la ploidía del ADN y las aberraciones cromosómicas segmentarias para clasificar a los pacientes en grupos de riesgo bajo, intermedio y alto8. 20. En la mayoría de los pacientes clasificados como de bajo riesgo se puede observar la regresión espontánea del tumor o tratarlos únicamente con resección quirúrgica21. Las personas con enfermedad de riesgo intermedio suelen ser tratadas con quimioterapia neoadyuvante con múltiples agentes seguida de resección quirúrgica21. Los pacientes de alto riesgo reciben un régimen de tratamiento intensivo que incluye una fase de inducción con quimioterapia con múltiples agentes y resección quirúrgica, una fase de consolidación de quimioterapia en dosis altas con rescate de células madre autólogas y radioterapia, y una fase posterior a la consolidación en la que los pacientes a menudo reciben inmunoterapia para centrarse en una enfermedad residual mínima, en un esfuerzo por prevenir la recaída22. Los resultados varían considerablemente entre los grupos: los pacientes de bajo riesgo experimentan una supervivencia general a 5 años del 98 % en comparación con el 62 % de aquellos con enfermedad de alto riesgo8. Debido a esta diferencia sustancial en el pronóstico, se han dirigido grandes esfuerzos a la desintensificación del tratamiento para pacientes de riesgo bajo e intermedio23,24 y a la intensificación del tratamiento para pacientes de alto riesgo25,26,27 para mejorar los resultados en el neuroblastoma.

Además de mejorar la eficacia de los enfoques terapéuticos, los esfuerzos para mejorar los resultados de los pacientes con neuroblastoma se han centrado en el desarrollo de herramientas de estratificación del riesgo clínico y molecular para informar la toma de decisiones clínicas28. En particular, una mejor estratificación de los pacientes con neuroblastoma puede permitir la intensificación y desintensificación del tratamiento para los pacientes apropiados, minimizando la toxicidad y maximizando el beneficio terapéutico21. Esto es particularmente importante en el neuroblastoma, dado que las poblaciones pediátricas corren el riesgo de sufrir complicaciones tardías por toxicidad de los regímenes de quimioterapia y radioterapia durante el desarrollo temprano29.

Se ha trabajado mucho en el desarrollo de nuevos biomarcadores moleculares para predecir el pronóstico de los pacientes con neuroblastoma, incluidos estudios de ARN largos no codificantes30,31, mircoARN32,33 y aberraciones genómicas34. Sin embargo, la categoría mejor estudiada de biomarcadores de pronóstico para el neuroblastoma utiliza tecnologías de secuenciación transcriptómica de alto rendimiento para identificar predictores basados en la expresión genética conocidos como firmas genéticas. Muchos estudios han intentado generar tales firmas en el neuroblastoma35,36,37,38, variando sustancialmente con respecto a las técnicas estadísticas utilizadas, el rigor de la validación externa, las plataformas de cuantificación utilizadas y el número de transcripciones incluidas. Muchos de los estudios anteriores que intentaron desarrollar firmas de pronóstico para el neuroblastoma incorporaron conocimientos biológicos en la selección de genes de pronóstico. Algunos estudios utilizan análisis de expresión diferencial o grupos ontológicos de genes implicados en vías de señalización, tumorigénesis o agresividad del neuroblastoma para restringir su conjunto de transcripciones candidatas39,40,41,42. Si bien estos enfoques tienen información biológica y pueden impulsar una mejor comprensión de la biología que sustenta el neuroblastoma, limitar la selección de genes de esta manera puede excluir aquellos con importancia pronóstica que actualmente no están asociados con procesos biológicos implicados en el neuroblastoma. Además, solo una pequeña cantidad de estas firmas se han desarrollado y validado en diferentes plataformas de cuantificación de transcripciones, lo que limita la generalización de las herramientas desarrolladas43. Además, la traducción clínica de muchas de estas firmas propuestas puede resultar difícil dada la gran cantidad de transcripciones incluidas, que requerirían análisis costosos y complejos, o la falta de un mecanismo propuesto para ayudar a los médicos a incorporar técnicas de estratificación de riesgo existentes con las firmas generadas para crear más grupos de riesgo matizados44. Como resultado de estos factores, no existen firmas transcriptómicas para pacientes con neuroblastoma que se utilicen actualmente en el entorno clínico.

En este estudio, utilizando un enfoque de aprendizaje automático biológicamente imparcial, desarrollamos y validamos externamente una firma transcriptómica de 21 genes que predice la supervivencia general (SG) y la supervivencia libre de eventos (SSC) para pacientes con neuroblastoma. En el análisis multivariado con covariables clínicas relevantes, nuestra firma siguió siendo un factor pronóstico independiente. Finalmente, construimos un modelo de estratificación de riesgos clínicamente traducible combinando nuestra firma de 21 genes con características clínicas y moleculares que se utilizan actualmente para el pronóstico del neuroblastoma.

Se utilizó un diseño de estudio de dos fases: la fase de descubrimiento inicial consistió en desarrollar una firma de pronóstico mediante análisis in silico de datos de expresión de microarrays, y una fase de validación posterior se utilizó para determinar la utilidad de pronóstico de la firma en dos experimentos externos e independientes. cohortes.

El conjunto de datos de descubrimiento estuvo formado por pacientes inscritos en el estudio de neuroblastoma de la iniciativa Investigación terapéuticamente aplicable para generar tratamientos eficaces (TARGET) (n = 249) (ID del subestudio phs000467). Las muestras analizadas en esta cohorte consisten en muestras de tumores primarios incorporadas a temperatura de corte óptima (OCT) recolectadas en el momento del diagnóstico de pacientes inscritos en estudios COG y ensayos clínicos. Se prepararon muestras y se cuantificó la transcripción según lo descrito por el consorcio TARGET45. En resumen, la cuantificación de la transcripción se realizó en un microarray Affymetrix Human Exon ST 1.0 y se escaneó según las instrucciones del fabricante. Los datos de la transcripción se normalizaron y resumieron mediante el análisis rma-sketch (que se aproxima a la normalización cuantil) utilizando herramientas eléctricas de Affymetrix. Se eliminaron los conjuntos de sondas con baja expresión y baja variación y los conjuntos de sondas resultantes se promediaron mediante identificación de transcripción basada en anotaciones de Affymetrix. Los datos clínicos y transcriptómicos se obtuvieron del repositorio de neuroblastoma TARGET disponible en https://portal.gdc.cancer.gov/projects.

Se utilizaron dos cohortes independientes para validar la firma generada en el conjunto de datos de descubrimiento, E-MTAB-179 y GSE85047. La cohorte E-MTAB-179 (n = 478) consta de muestras de tejido de neuroblastoma primario congelado instantáneamente obtenidas antes del tratamiento citotóxico como se describió anteriormente46. Esta cohorte cuantificó la expresión de la transcripción utilizando una matriz de neuroblastoma Agilent personalizada (A-MEXP-1746). Los datos clínicos y transcriptómicos de esta cohorte se obtuvieron de la plataforma ArrayExpress del Instituto Europeo de Bioinformática (ID de acceso E-MTAB-179). Los datos transcriptómicos se normalizaron utilizando un algoritmo cuantil. La cohorte GSE85047 (n = 283) consta de muestras de tejido de neuroblastoma primario obtenidas antes del tratamiento del Neuroblastoma Research Consortium (NRC) y se procesó como se describió anteriormente47. La cuantificación de la transcripción en esta cohorte se realizó utilizando un microarray Affymetrix Human Exon ST 1.0. Los datos de transcripción descargados se normalizaron y resumieron mediante el análisis rma-sketch, que se aproxima a la normalización cuantil, utilizando herramientas eléctricas de Affymetrix. Los datos clínicos y de expresión para esta cohorte se obtuvieron del Gene Expression Omnibus (ID de acceso GSE85047).

Las transcripciones de los candidatos en la cohorte de descubrimiento se filtraron para incluir solo aquellas presentes en todas las cohortes de descubrimiento y validación, para garantizar que cualquier firma de pronóstico generada pudiera validarse (n = 1780). Los pacientes en etapa 4 fueron excluidos de análisis adicionales (TARGET n = 0, GSE85047 n = 27, E-MTAB-179 n = 62) ya que las características genéticas, epigenéticas y transcriptómicas únicas que impulsan la regresión espontánea y los mejores resultados en estos pacientes pueden han interferido con la selección de transcripciones candidatas que fueron ampliamente pronósticas en otras etapas del neuroblastoma48. Además, aquellos a los que les faltaban variables patológicas o de supervivencia (TARGET n = 6, GSE85047 n = 16, E-MTAB-179 n = 0) también fueron excluidos de análisis adicionales. Después de las exclusiones, se incluyó un total de 243 pacientes en la cohorte TARGET, 240 en la cohorte GSE85047 y 416 en la cohorte E-MTAB-179 para análisis adicionales. Se muestran los datos clínico-patológicos y demográficos de los pacientes para las cohortes (Tabla 1).

Para crear un modelo de pronóstico a partir de los perfiles de expresión de la cohorte de neuroblastoma TARGET, se utilizó la regresión regularizada del Operador de selección y contracción mínima absoluta (LASSO) que emplea riesgos proporcionales de Cox (CoxPH) (disponible a través del paquete glmnet R). Esta técnica es un modelo de aprendizaje automático biológicamente imparcial que es útil en casos donde el número de predictores es mucho mayor que el número de observaciones y, por lo tanto, es particularmente adecuado para datos transcriptómicos. Se realizó una validación cruzada de 20 veces con pérdida de desviación de probabilidad parcial para obtener la lambda óptima (0,1006), que representa el parámetro de regularización utilizado en la creación del modelo final. Después del ajuste lambda, el modelo se generó con un alfa de 1 para limitar la cantidad de funciones seleccionadas. La SSC se utilizó como criterio de valoración principal para generar el modelo de pronóstico.

La SSC se utilizó como criterio de valoración principal y la SG como criterio de valoración secundario para todos los análisis estadísticos. Los pesos del modelo obtenidos en la fase de descubrimiento del estudio se utilizaron en todos los análisis de validación posteriores para evitar la sobreestimación del efecto causado por el reentrenamiento de la firma. Se utilizó el análisis univariante de regresión CoxPH para estimar el índice de riesgo (HR) para evaluar la asociación de la firma de pronóstico obtenida con la SSC y la SG en cohortes de descubrimiento y validación. En todos los análisis se utilizó la puntuación de riesgo de la firma mediana para subgrupos de pacientes en grupos de riesgo bajo y alto. Las curvas de SSC y SG se visualizaron mediante curvas de Kaplan-Meier. Se construyeron curvas de características del operador receptor (ROC) de 5 años para evaluar la sensibilidad y especificidad de la firma pronóstica en la predicción de los resultados de supervivencia. Se informan intervalos de confianza del 95% para el análisis de regresión, así como para las curvas ROC y Kaplan-Meier.

Para evaluar el desempeño de la firma pronóstica dentro de subgrupos clínicamente importantes, los pacientes se estratificaron según la edad en el momento del diagnóstico (> 18 meses o < 18 meses), el estado de amplificación de MYCN (amplificado o no amplificado) y el estadio INSS (I/II o III/ IV). Una vez estratificados, los pacientes de cada subgrupo se dividieron en grupos de alto y bajo riesgo según la puntuación de riesgo de la firma de pronóstico mediana, y se realizó una regresión CoxPH univariada para evaluar la utilidad pronóstica de la firma en estos subgrupos.

Para evaluar el valor pronóstico independiente de la firma, se dicotomizaron las variables clínico-patológicas disponibles: edad en el momento del diagnóstico (> 18 meses versus < 18 meses), estado de amplificación de MYCN (amplificado versus no amplificado) y estadio INSS (I/II versus III). /IV). Se realizó una regresión univariante de CoxPH en variables clínico-patológicas para evaluar su asociación con los resultados de supervivencia, y las variables asociadas significativamente se retuvieron para la regresión multivariada de CoxPH con las puntuaciones dicotomizadas para la firma de 21 genes.

Ambas cohortes de validación se agruparon y las variables clínico-patológicas dicotomizadas y el riesgo característico se regredieron en un análisis multivariado de CoxPH. Luego, este modelo multivariado se utilizó para generar nomogramas para la predicción de resultados de supervivencia a 5 años. Estos nomogramas generaron una puntuación de riesgo combinada que incorpora el grupo de riesgo característico, así como el estado de la variable clínico-patológica de pronóstico. Se trazaron curvas de Kaplan-Meier para visualizar las diferencias de supervivencia entre los grupos de alto y bajo riesgo utilizando la mediana de la puntuación de riesgo combinada como punto de corte; Se utilizó el análisis CoxPH univariado para evaluar la asociación de la puntuación de riesgo combinada con la supervivencia. También se generaron curvas ROC para determinar la sensibilidad y especificidad para la predicción de los resultados de supervivencia a 5 años para la puntuación de riesgo combinada en comparación con variables clínico-patológicas dicotomizadas o la firma pronóstica sola.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando R (versión 3. 4. 1; http://www.r-project.org/). Todos los valores de P informados son de dos colas y se utilizó un alfa de 0,05 como umbral de significación estadística.

La regresión penalizada LASSO utilizando el modelo CoxPH en la cohorte de descubrimiento TARGET identificó un conjunto de 21 genes asociados significativamente con la SSC en pacientes con neuroblastoma (Fig. 1). De los genes incluidos en la firma, 10 se asociaron con un mejor pronóstico y 11 se asociaron con un mal pronóstico (Tabla complementaria 1). La firma discriminó efectivamente entre pacientes con buen y peor pronóstico en la cohorte de descubrimiento (TARGET HR 4,20 [2,89–6,10], p <0,0001) (Fig. 2A). Estos hallazgos se validaron en múltiples cohortes de validación, donde se observaron diferencias significativas en la SSC según la puntuación de riesgo característica (GSE85047: HR 4,20 [2,82–8,65], p < 0,0001; E-MTAB-179: HR 5,87 [3,83–9,01] , p < 0,0001) (Fig. 2B,C). Las curvas ROC a 5 años en las cohortes de descubrimiento y validación también demostraron una capacidad sustancial para predecir la SSC en pacientes con neuroblastoma (AUC OBJETIVO = 0,898; AUC GSE85047 = 0,815; AUC E-MTAB-179 = 0,827) (Fig. 2D,F). También se observaron asociaciones similares entre la firma generada y el sistema operativo. La firma de 21 genes pudo estratificar la SG en todo el descubrimiento (TARGET HR 4,20 [2,89–6,10], p <0,0001) y cohortes de validación (GSE85047; HR 4,941 [2,823–8,647], p <0,0001; E-MTAB-179; 37,240 [11,760–117,900], p < 0,0001) (Figura complementaria 1 AC). De manera similar, las curvas ROC a 5 años demostraron una utilidad predictiva sustancial de la firma de 21 genes para OS (TARGET AUC = 0,840; GSE85047 AUC = 0,833; E-MTAB-179 AUC = 0,904) (Figura complementaria 1 DF). Estos resultados demuestran que hemos identificado una firma de 21 genes que predice sólidamente los resultados tanto de SG como de SSC en pacientes con neuroblastoma.

Mapa de calor de expresión de genes incluidos en la firma de pronóstico de 21 genes. Cada columna representa un paciente en la cohorte de descubrimiento de neuroblastoma TARGET (n = 243) y cada fila representa un gen incluido en el modelo. Los pacientes se organizan de bajo riesgo (izquierda) a alto riesgo (derecha) según la puntuación de riesgo de 21 genes y los genes se organizan desde la asociación positiva más alta con el riesgo (abajo) hasta la asociación negativa más alta con el riesgo (arriba). El gráfico de líneas demuestra la puntuación de riesgo de los pacientes calculada mediante la firma de pronóstico de 21 genes, con valores bajos asociados con riesgo bajo y valores altos asociados con riesgo alto (A). Para el mapa de calor, el azul representa una expresión baja y el naranja representa una expresión alta. Los genes por encima de la separación se asocian positivamente con el riesgo y los genes por debajo de la separación se asocian negativamente con el riesgo. Las variables clínicas, incluido el estado de amplificación de MYCN, el estadio INSS y la edad en el momento del diagnóstico, se muestran como anotaciones para cada paciente de la muestra (B).

Supervivencia libre de eventos estratificada por puntuación de riesgo de firma de pronóstico de 21 genes en cohortes de descubrimiento y validación. Curvas de supervivencia de Kaplan Meier con análisis de riesgos proporcionales de Cox que muestran el riesgo de supervivencia libre de eventos en grupos de bajo riesgo (curva negra) y alto riesgo (curva gris) generadas utilizando un punto de corte mediano para la puntuación de riesgo de 21 genes y un análisis de la curva ROC que demuestra la capacidad predictiva de la puntuación de riesgo para la supervivencia libre de eventos a 5 años en la cohorte de descubrimiento (Panel A y B), la cohorte de validación GSE85047 (Panel C y D) y la cohorte de validación E-MTAB-179 (Panel E y F).

Además de predecir la supervivencia dentro de cohortes de neuroblastoma no estratificadas, se realizó un análisis dentro de subgrupos clínicamente relevantes para evaluar si la firma de 21 genes identificada podría utilizarse para estratificar a estos pacientes con mayor precisión. Los pacientes en las cohortes de validación se subdividieron iterativamente según la edad en el momento del diagnóstico (> 18 meses o < 18 meses), el estado de amplificación de MYCN (amplificado o no amplificado) y el estadio INSS (I/II o III/IV) y se utilizó CoxPH univariado para evaluar asociación de firma con la supervivencia. En ambas cohortes de validación, la firma de 21 genes demostró una capacidad significativa para estratificar la SSC dentro de los subgrupos de edad < 18 meses en el momento del diagnóstico, edad > 18 meses en el momento del diagnóstico, estadio INSS III/IV y estado de MYCN no amplificado (Tabla 2). Se observaron tendencias similares en el análisis de OS, con la firma capaz de estratificar dentro de edades < 18 y > 18 meses en el momento del diagnóstico, pacientes en estadio III/IV del INSS y con estado MYCN no amplificado en la cohorte GSE85047. En la cohorte E-MTAB-179, debido a la ausencia de eventos de SG en los estratos de bajo riesgo de los subgrupos de estadio I/II del INSS y edad < 18 meses en el momento del diagnóstico, no se pudieron realizar estos análisis específicos. Sin embargo, la firma siguió siendo significativa dentro de los grupos de edad> 18 meses en el momento del diagnóstico, estadio INSS III/IV y estado de MYCN no amplificado (Tabla complementaria 2). Un análisis adicional en una cohorte de validación agrupada demuestra que la firma obtenida es un fuerte predictor de SSC en pacientes con múltiples factores de pronóstico clínico-patológico asociados con bajo riesgo (Tabla complementaria 3), aunque hallazgos similares no se replicaron en la SG dada la escasez de eventos en para esta medida de resultado (Tabla complementaria 4) Estos hallazgos sugieren que la firma de 21 genes generada puede ser útil para la identificación de pacientes con neuroblastoma con mayor y menor riesgo incluso dentro de los subgrupos clínicos existentes que actualmente se utilizan para el pronóstico.

Se realizaron análisis CoxPH univariados y multivariados para comparar la firma con diversas características clínico-patológicas, incluida la edad en el momento del diagnóstico, el estado de amplificación de MYCN y el estadio INSS. Los pacientes en las cohortes de validación se clasificaron en subgrupos clínico-patológicos como antes, y en grupos de alto y bajo riesgo según la puntuación de riesgo mediana de la firma de 21 genes. En el análisis univariado de CoxPH, la edad > 18 meses en el momento del diagnóstico, el estadio III/IV del INSS, la amplificación de MYCN y la puntuación de riesgo alta de 21 genes fueron predictores significativos de supervivencia deficiente en ambas cohortes de validación (p < 0,0001 para todos los análisis) (Tabla 3) . El análisis multivariado de CoxPH que utiliza características estadísticamente significativas en el modelado univariado demostró que la puntuación de riesgo de 21 genes identificada seguía siendo un factor de pronóstico independiente para predecir los resultados en pacientes con neuroblastoma. Además de la firma pronóstica, el estadio INSS y el estado de MYCN también surgieron como factores de riesgo independientes, mientras que la edad en el momento del diagnóstico solo se asoció significativamente en la cohorte de validación GSE85047 (Tabla 3). Estos resultados indican que la firma de pronóstico de 21 genes mantuvo su asociación independiente con la SSC cuando se analizó en un análisis multivariado ajustando las covariables clínico-patológicas significativas. El análisis de OS reveló tendencias similares en el análisis univariante de CoxPH, siendo todas las variables significativas (Tabla complementaria 5). En el análisis multivariado, todas las variables mantuvieron su importancia en la cohorte E-MTAB-179; sin embargo, la firma de 21 genes no se asoció significativamente con la supervivencia en la cohorte GSE85047 (Tabla complementaria 5).

Para mejorar el rendimiento y la utilidad clínica de la firma de 21 genes generada, se utilizó regresión multivariada para incorporar la firma con variables clínico-patológicas significativas para generar una puntuación de riesgo combinada. Se agruparon cohortes de validación para estos análisis y se realizó CoxPH multivariado que incorpora la firma de 21 genes, la edad en el momento del diagnóstico, el estado de amplificación de MYCN y el estadio INSS. El análisis en la cohorte agrupada para SSC y SG demostró que la identidad de la cohorte de validación no se asoció con la supervivencia (SSC p = 0,5210, SG p = 0,5270), mientras que la puntuación de la firma de 21 genes, la edad en el momento del diagnóstico, el estado de MYCN y el estadio INSS se mantuvieron significativo. Estas características clínico-patológicas y la puntuación de 21 genes se utilizaron para generar un nomograma que proporciona una puntuación de riesgo combinada para los resultados de SSC a 5 años (Fig. 3A) y resultados de SG a 5 años (Fig. 2A complementaria). Una puntuación de riesgo combinada más alta indicada por el nomograma se asocia con peores resultados de SSC a 5 años, con una puntuación de riesgo alta de 21 genes característicos, edad > 18 meses en el momento del diagnóstico, amplificación de MYCN y estadio III/IV del INSS que aumentan la puntuación de un paciente tanto en SSC como en SSC. Análisis del sistema operativo. La puntuación de riesgo combinada demostró una capacidad significativa para estratificar la SSC (HR 6,93 [4,89–9,83], p < 0,0001) (Fig. 3B) y la SG (HR 54,29 [20,10–146,60], p < 0,0001) en la cohorte de validación agrupada (Suplementaria Figura 2B). Las curvas ROC a 5 años también demostraron una capacidad mejorada para predecir resultados de supervivencia en comparación con la firma o cualquier variable clínico-patológica de forma aislada (EFS AUC = 0,839; OS AUC = 0,908) (Fig. 3C y Fig. Suplementaria 2C). Estos resultados sugieren que nuestra firma de riesgo de 21 genes se puede incorporar de manera efectiva con herramientas clínico-patológicas de uso común para mejorar la estratificación del riesgo y la predicción de los resultados de supervivencia en la clínica.

Nomograma que integra la puntuación de riesgo de 21 genes y otras variables clínico-patológicas para la predicción de la supervivencia libre de eventos a 5 años en una cohorte de validación agrupada. Nomograma que incorpora características clínico-patológicas y puntuación de riesgo de 21 genes para generar una puntuación de riesgo combinada (Panel A). Curvas de supervivencia de Kaplan Meier con análisis de riesgos proporcionales de Cox que muestran el riesgo de supervivencia libre de eventos en grupos de bajo riesgo (curva negra) y alto riesgo (curva gris) generadas utilizando un punto de corte mediano para la puntuación de riesgo pronóstico combinado en la cohorte de validación agrupada ( Panel B). Análisis de la curva ROC que demuestra la capacidad predictiva de la puntuación de riesgo combinada en comparación con la puntuación de riesgo de 21 genes y otras variables clínico-patológicas de forma aislada para una supervivencia libre de eventos a 5 años en la cohorte de validación agrupada (Panel C).

A pesar de los espectaculares avances en las estrategias de tratamiento del neuroblastoma en las últimas décadas, la estratificación del riesgo continúa presentando una barrera para la atención clínica de los pacientes con neuroblastoma28. Como tumor altamente heterogéneo, estratificar a los pacientes con enfermedad agresiva de aquellos con enfermedad relativamente indolente presenta un valor significativo para informar las estrategias de intensificación y desintensificación terapéutica21. Si bien las herramientas de estratificación del riesgo han sido efectivas para mejorar los resultados de los pacientes, sigue habiendo subpoblaciones de pacientes que pueden beneficiarse de una estratificación del riesgo más precisa para maximizar el beneficio del tratamiento y reducir la morbilidad asociada con la alta carga del tratamiento29. Este estudio utilizó un enfoque de aprendizaje automático imparcial, la regresión de CoxPH regularizada LASSO, para generar y validar de manera sólida una nueva firma transcriptómica de 21 genes que es capaz de predecir con precisión los resultados de SSC y SG a 5 años en pacientes con neuroblastoma.

La firma de 21 genes demostró una capacidad sustancial para estratificar la SSC y la SG en todas las cohortes estudiadas y fue capaz de predecir de manera efectiva los resultados de supervivencia a 5 años para los pacientes, con valores de AUC superiores a 0,8 para todos los análisis. Estos hallazgos sugieren que la firma obtenida tiene un fuerte valor pronóstico y respalda la capacidad de la firma de 21 genes para proporcionar información de pronóstico clínicamente significativa. Además, la firma fue capaz de estratificar dentro de varias subpoblaciones relevantes, incluido el subgrupo clínico no amplificado de MYCN, que demuestra una heterogeneidad pronóstica sustancial49. La firma desarrollada también conservó su efecto pronóstico independiente en el análisis multivariado con variables clínico-patológicas, incluida la edad en el momento del diagnóstico, el estado de amplificación de MYCN y el estadio INSS, todos los cuales se utilizan en diversos grados para estratificar el riesgo de los pacientes con neuroblastoma. Estos resultados respaldan la utilidad de la firma para estratificar a los pacientes independientemente de sus características clínico-patológicas en el momento de la presentación. Dado este sólido desempeño, generamos un nomograma intuitivo para permitir una fácil incorporación del riesgo definido por la firma de 21 genes con estas variables clínico-patológicas para los resultados de SSC y SG. Cuando se combina con estos factores de riesgo clínico-patológicos para generar una puntuación de riesgo combinada utilizando estas herramientas, la capacidad predictiva de la firma mejoró aún más que la de los factores de riesgo o la firma de pronóstico sola, lo que valida el beneficio sinérgico de combinar variables y proporciona una herramienta mejorada de estratificación del riesgo. que incorpora la contribución tanto de las características clínicas como de los correlatos biológicos. Es de destacar que la puntuación de riesgo combinada tuvo un AUC de 0,839 y 0,908 para la predicción de los resultados de SSC y SG a 5 años, respectivamente, lo que sugiere una gran utilidad pronóstica. Además de sus sólidas capacidades de pronóstico en numerosos resultados y la facilidad de incorporarla con variables clínico-patológicas existentes, la firma de 21 genes tiene la ventaja adicional de desarrollarse en numerosas plataformas. Las cohortes de validación utilizadas en este estudio cuantificaron la expresión génica utilizando el microarray Affymetrix Human Exon ST 1.0 y un microarray Agilent personalizado para la cohorte GSE85047 y la cohorte E-MTAB-179, respectivamente. Pocos otros estudios de firmas de pronóstico para el neuroblastoma han utilizado análisis multiplataforma43, y la alta utilidad predictiva de nuestra firma en todas las plataformas sugiere que su asociación con la supervivencia es independiente de la tecnología de cuantificación utilizada. Hasta donde sabemos, la puntuación de riesgo combinada desarrollada en este estudio representa la mayor precisión predictiva, en cohortes de validación externa independientes, de una firma multiplataforma para la predicción de los resultados de SSC y SG del neuroblastoma.

Se han realizado numerosos estudios que han buscado generar nuevas firmas transcriptómicas para el pronóstico del neuroblastoma, incorporando diversas técnicas estadísticas y metodológicas35,36,37,38. Se han desarrollado múltiples firmas para su uso en subgrupos particulares de neuroblastoma, particularmente entre pacientes de alto riesgo50,51. Además, varios investigadores se han esforzado en crear firmas biológicamente armonizadas, seleccionando genes asociados con vías de señalización o del ciclo celular, como MYCN40, o procesos biológicos implicados en el neuroblastoma, como los relacionados con la hipoxia41. Estas firmas han demostrado un sólido rendimiento pronóstico en los análisis de validación y han generado nuevos conocimientos sobre los mecanismos celulares que pueden subyacer a la agresividad de un subconjunto de casos de neuroblastoma de alto riesgo40,41. En estos estudios se han utilizado varias tecnologías transcriptómicas diferentes, incluido el uso de plataformas RT-qPCR36 y nanoString nCounter44, que son particularmente importantes dada la facilidad de traducir dichos ensayos al entorno clínico. Los análisis anteriores también han variado significativamente con respecto a los métodos utilizados para generar firmas en su trabajo, con la regresión CoxPH por pasos52, las máquinas de vectores de soporte53 y las redes neuronales artificiales54 entre los más utilizados, y muchos de ellos muestran un rendimiento razonable en la estratificación de la supervivencia.

El enfoque utilizado en el presente estudio tiene múltiples ventajas que se suman significativamente a la literatura existente. En primer lugar, utilizamos un enfoque de aprendizaje automático sin selección a priori de transcripciones candidatas, lo que permite la identificación e inclusión de los genes de pronóstico más relevantes. Además, a diferencia de los enfoques de redes neuronales, la regresión CoxPH regularizada LASSO utilizada en este trabajo permite utilizar un modelo matemático simple para calcular el riesgo del paciente, lo que permite una integración más fácil en los flujos de trabajo clínicos. Además, nuestra firma estratifica tanto la SG como la SSC, los cuales son resultados de supervivencia que se utilizan de forma rutinaria en los ensayos clínicos del COG e INRG8 y son fundamentales para el asesoramiento de pacientes y familiares en el entorno clínico. Finalmente, demostramos la independencia de nuestra firma y generamos nomogramas intuitivos para permitir un cálculo sencillo de las puntuaciones de riesgo que incorporan nuestra firma. Finalmente, la firma presentada muestra un rendimiento pronóstico mejorado en los análisis de validación en comparación con muchas de las firmas existentes descritas en la literatura, lo que proporciona una utilidad incremental como biomarcador molecular para el neuroblastoma.

Aunque las funciones precisas de muchos genes incluidos en nuestra firma de pronóstico aún no están claras, anteriormente se han asociado múltiples genes con la fisiopatología y el pronóstico del neuroblastoma. El aumento de la expresión de ECEL1 se ha asociado con un pronóstico favorable y un fenotipo más benigno en múltiples estudios in vitro55 y se ha incluido en firmas de pronóstico anteriores para el neuroblastoma35,44. La expresión de HOXC9 se ha asociado con la regresión espontánea del neuroblastoma y es un marcador de pronóstico positivo para la supervivencia56,57. De manera similar, la disminución de la expresión de los miembros de la familia de genes GABARAP y GABAérgicos se ha asociado con malos resultados en un subconjunto de pacientes con neuroblastoma58. Además, la expresión de DYRK3 se ha asociado con un papel potencial en la diferenciación y el control hipóxico de líneas celulares de neuroblastoma en estudios in vitro59. Aunque la expresión de GNA14 no se ha asociado fuertemente con la supervivencia del neuroblastoma, las mutaciones somáticas en este gen se han asociado con tumores vasculares congénitos y esporádicos60. Es importante destacar que la contribución de estos genes al riesgo, según lo predicho por nuestra firma, tiene la misma direccionalidad que la asociación con la supervivencia descrita en la literatura, lo que indica que nuestros hallazgos están en línea con trabajos previos en esta área. Dada la asociación de los 21 genes identificados en este estudio con la supervivencia, pueden representar un subconjunto de contribuyentes funcionalmente relevantes a la agresividad del neuroblastoma o la susceptibilidad a la enfermedad del huésped. Como tal, una mayor investigación de estos genes, incluidos aquellos con contribución positiva a la puntuación de riesgo (supuestos oncogenes) o aquellos con contribución negativa a la puntuación de riesgo (supuestos genes supresores de tumores), puede ayudar a caracterizar mejor los mecanismos subyacentes a la heterogeneidad de los resultados del neuroblastoma.

En este estudio se utilizaron tres conjuntos de datos independientes para los cuales se disponía de datos clínico-patológicos, de seguimiento y de expresión para desarrollar un fuerte predictor de los resultados de SSC y SG en pacientes con neuroblastoma. Nuestro enfoque no estuvo sesgado por ningún conocimiento biológico a priori y, por lo tanto, el conjunto de genes candidatos no estaba restringido por este motivo, lo que permitió seleccionar los genes de pronóstico más importantes. Sin embargo, el conjunto de genes candidatos se restringió en este análisis a los cuantificados por las tres cohortes seleccionadas. Si bien en este análisis se incluyó una gran selección de genes, la exclusión de genes que no estaban presentes en todas las cohortes puede haber eliminado candidatos potencialmente importantes del desarrollo característico. Además, el análisis multivariado también se limitó a variables presentes en las tres cohortes. Por lo tanto, factores potencialmente útiles como el sexo del paciente, el estadio INRGSS y la clasificación de riesgo del COG no pudieron incorporarse de manera efectiva en el nomograma para el análisis combinado. A pesar de esto, nuestra firma todavía tiene una utilidad pronóstica sustancial y el trabajo futuro debería intentar incorporar la firma presentada con otros marcadores de pronóstico clínico-patológicos y transcriptómicos para mejorar aún más su desempeño.

Se está traduciendo un número cada vez mayor de firmas transcriptómicas al entorno clínico, lo que demuestra aún más la utilidad y traducibilidad de los biomarcadores moleculares. En particular, se han validado múltiples firmas genéticas para guiar la selección de tratamientos y la predicción de recaídas y se encuentran en uso clínico en el campo del cáncer de mama61,62, al igual que herramientas para una identificación más precisa de nódulos cancerosos en el área del cáncer de tiroides63. Antes de la implementación de la firma de riesgo de 21 genes identificada en entornos clínicos, se debe desarrollar y validar un ensayo de cuantificación confiable. Esto podría incluir PCR en tiempo real o métodos específicos basados en secuenciación de próxima generación. Dado que la firma ha sido validada en múltiples plataformas de expresión, es probable que cualquiera de estas tecnologías pueda utilizarse con éxito. Después de estos estudios, será fundamental probar prospectivamente esta firma en grandes ensayos clínicos multicéntricos para incorporarla como herramienta de pronóstico en la estratificación y el tratamiento del riesgo de neuroblastoma. En resumen, nuestra firma de pronóstico combinado puede ayudar a identificar un subconjunto de pacientes con mal pronóstico que son candidatos para intensificación del tratamiento y seguimiento estrecho.

La expresión genética y los datos clínicos incluidos en este estudio se obtuvieron de los siguientes conjuntos de datos disponibles públicamente: iniciativa de investigación terapéuticamente aplicable para generar tratamientos eficaces (TARGET) (ID del subestudio phs000467), Array Express (Accession E-MTAB-179) y el Expresión genética Omnibus (Accesión GSE86047). Todos los demás datos relevantes para el estudio estarán disponibles previa solicitud razonable de los autores correspondientes.

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Este estudio fue financiado en parte por una subvención de (AN) la Fundación del Hospital Infantil de Alberta y la Fundación para el cuidado del cáncer infantil de Alberta. MG recibió la beca de la Brain Tumor Foundation.

Estos autores contribuyeron igualmente: Mehul Gupta y Sunand Kannappan.

Departamento de Pediatría y Oncología, Facultad de Medicina Cumming, Universidad de Calgary, 3330 Hospital Drive NW, Calgary, AB, T2N 4N1, Canadá

Mehul Gupta, Sunand Kannappan, Mohit Jain, Ravi Shah y Aru Narendran

Departamento de Pediatría, Sección de Hematología/Oncología, Hospital Infantil de Arkansas, Universidad de Ciencias Médicas de Arkansas, Little Rock, AR, 72202, EE. UU.

David Douglass

Departamentos de Oncología y Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina Cumming, Universidad de Calgary, 3330 Hospital Drive NW, Calgary, AB, T2N 4N1, Canadá

Pinaki Bose y Aru Narendran

Escuela de Medicina Cumming, Instituto del Cáncer Arnie Charbonneau, Universidad de Calgary, Calgary, AB, T2N 4N1, Canadá

Pinaki Bose y Aru Narendran

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MG y SK adquirieron los datos necesarios, realizaron el análisis, prepararon las figuras y coescribieron el manuscrito. MJ, DD y RS realizaron revisiones extensas del manuscrito y las figuras. AN y PB concibieron y supervisaron el estudio y coescribieron el manuscrito.

Correspondencia a Pinaki Bose o Aru Narendran.

PB es vicepresidente ejecutivo y cofundador de OncoHelix Inc. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Gupta, M., Kannappan, S., Jain, M. et al. Desarrollo y validación de una firma pronóstica de 21 genes en neuroblastoma. Informe científico 13, 12526 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37714-9

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Recibido: 13 de enero de 2023

Aceptado: 26 de junio de 2023

Publicado: 02 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37714-9

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